AAV载体设计与构建

派真生物精心设计的专利型AAV Cas9表达载体，可在​​单载体​​中表达：​​SpCas9、SaCas9​​、​​sgRNA​​或者​​Cas9和sgRNA。

可在派载体中设计

• SpCas9：双载体或单载体
  派真生物精心设计的专利型 SpCas9 表达载体，可在单个 AAV 载体中共表达 SpCas9 和 sgRNA。为了确保 SpCas9 表达序列不超过 AAV 载体容量（约 5Kb），派真生物使用紧凑高效的启动子序列 EF1s 或 miniCMV。对于 sgRNA 表达，派真生物使用高效且相对较短的 H1 启动子来缩短 sgRNA 表达框的总碱基长度。通过这种策略，派真构建了一个能够高效地共表达 SpCas9 和 sgRNA 的单个 AAV CRISPR 载体，最大限度地降低了混合细胞表达表型的风险以及产生不一致或假阳性数据的可能性。
• SaCas9: 双载体或单载体
  SaCas9是Cas9的紧凑型变体，其基因长度仅约​​3.2 kb​​（SpCas9为4.2 kb），在保持与SpCas9相当的DNA切割活性同时，显著适配AAV载体的容量限制。此外，SaCas9识别PAM序列为​​NNGRRT​​，在宿主基因组中出现频率低（约每32 bp出现一次），大幅降低非靶标区域结合概率。SaCas9靶向DNA序列长度为​​21-23 nt​​（SpCas9通常为20 nt），特异性更强。PAM 频率的降低和靶序列长度的延长使 SaCas9 具有更高的结合特异性，与传统 SpCas9 相比，理论上脱靶率更低。

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• SpCas9HF
  高保真SpCas9
• SaCas9HF
  高保真SaCas9
• AAV-CRISPR 激活MS2-P65-HSF1
  虽然Cas9通常与传统的sgRNA配对以实现靶向基因敲除，但其也可与​​经MS2 RNA连接支架修饰的sgRNA​​结合，实现类似的功能。在此改造后的MS2系统中，SpCas9失去DNA切割活性（变为dCas9），转而募集​​MS2-P65-HSF1转录激活复合体​​，驱动下游基因转录。该方法可实现​​内源基因的转录激活​​，表达水平可提升超过1000倍。
• NmCas9
  长度为 3.3 kb 的 NmCas9 是 Cas9 的替代版本，其活性与 SpCas9 相似，但在需要极低脱靶率的应用中更具优势。NmCas9 识别更长的 PAM 序列 (NNNNGATT)，其出现频率低于 SpCas9 PAM，大约每 128 bp 出现一次。再加上其 21-23 nt 的延伸靶序列长度，使其具有更高的靶特异性。这些特性使得 NmCas9 的脱靶率理论上低于其他 Cas9 变体，使其成为高精度基因组编辑应用的理想选择。
• AsCpf1 and LbCpf1
  虽然 Cas9 及其变体是最常用的 CRISPR 效应内切酶，但 Cpf1 内切酶作为 CRISPR 基因编辑的替代方案也越来越受欢迎。与 Cas9 类似，Cpf1 需要 gRNA 激活，结合邻近 PAM 序列的基因组 DNA，并在 sgRNA 靶序列退火后切割 DNA。然而，Cpf1 比 Cas9 短，因此需要更短的 sgRNA 才能发挥全部功能。另一个关键区别是，Cas9 产生平端 DNA 切口，而 Cpf1 产生 4-5 个碱基对突出的粘性末端，从而有助于低错误率且可控的基因插入。

什么是CRISPR?
CRISPR是一种​​尖端基因编辑技术​​，能够实现对目标基因的​​敲除​​（Knockout）、​​定点突变​​（Mutate）或​​过表达​​（Overexpress）。基于CRISPR的研究策略因其​​高效稳定​​的编辑性能与​​操作简便​​的作用机制，已在分子生物学、医学及农业等领域广泛应用

CRISPR 基因编辑需要三个组成部分：(1) 向导 RNA (gRNA)、(2) Cas9 内切酶和 (3) 目标基因组内的原型间隔区相邻基序 (PAM)。gRNA 是一种单链 RNA 分子，由两个区域组成：(1) 与目的基因的 15-24 个碱基对片段互补的基因靶向序列，以及 (2) 与 Cas9 结合的支架区。gRNA 支架区与 Cas9 内切酶结合，同时 gRNA 的宿主 DNA 补体区域不结合。然后，Cas9-gRNA 复合物可以扫描宿主细胞的基因组 DNA 以寻找称为 PAM 的特定 2-6 个碱基对序列。一旦 Cas9-gRNA 复合物识别 PAM 序列，gRNA 的基因靶向区域就会与 PAM 序列相邻的宿主 DNA 退火。在 gRNA 基因靶向区域成功结合后，Cas9 将切割与 PAM 序列相邻的宿主 DNA。

Cas9介导的DNA切割通常会导致基因转录严重中断，并在DNA修复后导致功能性基因敲除。或者，切割可用于引入精确的DNA突变，或使用修饰的gRNA支架区域来激活基因表达，该支架区域可抑制Cas9的切割能力，同时将转录蛋白募集到基因启动子区域。重要的是，靶DNA识别的特异性使得设计针对几乎任何基因的基于CRISPR的基因编辑策略成为可能。

基于 CRISPR 基因编辑的 AAV 载体设计和生产既具有挑战性又耗时。派真生物专业的团队拥有丰富的经验和专业知识，能够提供高质量的 CRISPR-AAV，省时又省力。

派真生物（PackGene）提供基于​​AAV载体的shRNA干扰技术​​，通过表达​​短发夹RNA（shRNA）​​实现靶基因蛋白翻译的高效抑制。我们的AAV-shRNA载体支持​​H1或U6启动子​​驱动shRNA表达，并可根据需求共表达​​荧光报告蛋白（如GFP、RFP）​​或​​药物筛选标签（如Puromycin抗性基因）​​，便于转染效率的实时监测与阳性细胞富集。此外，我们提供​​专家级shRNA克隆与载体构建技术支持​。​

Pol III启动子驱动的shRNA​| 基于miR30的shRNA​

RNA干扰（RNAi）是一种高度特异性的蛋白质敲低工具，利用小分子非编码RNA与目标蛋白mRNA结合，促进其降解，从而降低蛋白质翻译。RNAi机制内源性存在于大多数真核生物中，并已被广泛用作基因功能研究、药物研发和基因沉默治疗的分子工具。

最近的临床试验表明，RNAi 在靶向致病基因治疗人类疾病方面具有巨大潜力。与其他递送方法相比，基于 AAV 载体的 RNAi 表达已被证实能够在活体动物体内持续降低 mRNA 靶标。

PackGene 提供定制的抑制性 miRNA AAV 载体，旨在抑制活体动物体内内源性 miRNA 的表达和功能。与传统的合成 miRNA 抑制剂相比，AAV-miRNA 克隆技术可确保更高的表达持久性和更长的药效持续时间，同时提高安全性并最大限度地降低免疫原性。

miRNA 是真核生物内源性表达的小型非编码 RNA，在调控基因表达中起重要作用。miRNA 抑制剂是设计为内源性 miRNA 反向互补序列的 RNA 分子，功能性地阻断其基因调控能力。

派真生物提供直接、便捷、高效的 miRNA 抑制剂表达，用于动物体内实验，并可通过定制的 AAV 血清型靶向递送至特定器官和组织。与传统的合成 miRNA 抑制剂相比，该方法可确保更高的表达持久性和更长的药效持续时间，同时提高安全性并降低免疫原性。