前言
肌萎缩侧索硬化（ALS）是一种严重的进行性神经退行性疾病，主要累及中枢神经系统中的上、下运动神经元，导致进行性肌肉无力并最终危及生命，其确切致病机制至今尚未完全阐明，但多项研究表明，基因突变（如SOD1、FUS、C9orf72 等）、异常蛋白聚集、兴奋性毒性和神经炎症等因素都可能参与其中。尽管已有如利鲁唑（Riluzole）和依达拉奉（Edaravone）等药物，以及靶向SOD1、TDP-43 等基因的疗法陆续出现，目前仍缺乏从根本上减缓或逆转 ALS 病程的有效手段。
近年来，铁依赖的细胞程序性死亡形式——“铁死亡”（ferroptosis）尤为受到关注，因为其在运动神经元的退变过程中扮演了关键角色。在“铁死亡”（ferroptosis）过程中，过量铁会促进活性氧（ROS）的产生，从而氧化细胞膜上的多不饱和脂质（例如磷脂），形成各种氧化磷脂，其中就包括氧化磷脂酰胆碱（PC-OxPL）。这些氧化磷脂会在膜结构中累积并引发细胞膜损伤，进一步加剧神经元功能障碍或死亡。
近日，来自 VectorY Therapeutics、Tisch MS Research Center of New York 以及加州大学圣地亚哥分校等多家单位的研究团队在预印本平台（bioRxiv）上发布了一项新研究，提出利用 AAV 递送抗PC-OxPL的抗体片段，用以阻断 ALS 患者脑脊液和脑组织中富集的 PC-OxPL 所导致的神经毒性，从而保护运动神经元并抑制 TDP-43 的异常聚集。该研究为包括 ALS 在内的神经退行性疾病提供了新的干预思路，也展示了 AAV 基因疗法在复杂神经系统疾病应用中的潜力。
一、研究亮点
二、研究思路
三、主要研究结果
研究者对ALS患者的脑脊液和脑组织进行定量检测，发现多种氧化磷脂PC-OxPL大量富集（文章图1）。尤其是在脊髓腹角运动神经元区域，PC-OxPL与乙酰胆碱转移酶（ChAT）阳性细胞共定位，提示它与运动神经元损伤密切相关。
文章图1. PC-OxPL在ALS患者的大脑和脊髓中积累。a. 使用hE06全长抗体检测的PC-OxPL病理学代表性图像，展示了ALS病理学和进展的不同阶段特征。b. 左图：ALS患者和非痴呆对照组（NDC）脊髓中PC-OxPL积累的代表性图像。右图：通过红外（IR）面积和平均信号强度定量分析ALS患者和非痴呆对照组（NDC）脊髓中PC-OxPL的积累。c. 左图：脊髓灰质区域中PC-OxPL与ChAT共定位的代表性图像。右图：脊髓灰质区域中hE06/PC-OxPL与ChAT或DAPI共定位的线性分析。d. hE06/PC-OxPL与ChAT（上图）和DAPI（下图）的共定位分析。e. 与健康对照（HC）相比，ALS患者脑脊液中各（氧化）PC种类的浓度变化（Fold-change, FC）。f. 与健康对照（HC）相比，ALS患者血浆中各（氧化）PC种类的浓度变化。
文章图4. 靶向PC-OxPL的PC-OxPL-VecTab®，阻断iPSC衍生运动神经元的神经毒性。a. AAV5.2-CBh-PC-OxPL-VecTab®载体结构示意图（ITR：反向末端重复序列；CBh：CBA杂合启动子；SV40 pA：猴病毒40多聚腺苷酸化信号）。b. AAV5.2-GFP在人源细胞中的趋向性差异：包括皮层神经元、运动神经元、星形胶质细胞以及运动神经元-星形胶质细胞共培养。c.AAV转导后运动神经元和星形胶质细胞中PC-OxPL-VecTab®转录本的表达：两种类型细胞均使用不同MOI的AAV5.2-Control进行转导，并在转导后第8天收集细胞裂解液。d. AAV转导后运动神经元和星形胶质细胞中PC-OxPL-VecTab®的蛋白表达：两种类型细胞均使用AAV5.2-CBh-PC-OxPL-VecTab®进行转导，并在转导后第8天收集细胞外培养基。e. 运动神经元和星形胶质细胞中PC-OxPL-VecTab®转录本表达与蛋白浓度的相关性分析：两种细胞类型均使用不同MOI的AAV5.2-Control进行转导，并在转导后第8天收集细胞裂解液。f. AAV5.2-PC-OxPL-VecTab®转导野生型运动神经元后，暴露于PC-OxPL（PONPC）的基因表达网络分析：分析中使用了“神经炎症”和“神经病理学”两组数据。所有通路按富集倍数（Fold Enrichment）排序。g. AAV5.2-Control转导野生型运动神经元后，暴露于PC-OxPL（PONPC）的转录组恢复情况的热图展示。h. 野生型和TDP-43 M337V运动神经元转导小鼠或人源AAV5.2-PC-OxPL-VecTab®后，暴露于PSPC或PC-OxPL的TDP-43聚集情况：TDP-43聚集以HTRF TDP-43实验测量的聚集比值表示。
在sALS脑脊液小鼠模型中，通过将PC-OxPL-VecTab®注射至颈椎蛛网膜下隙，能有效中和PC-OxPL的毒性，原本因sALS脑脊液暴露而引起的运动神经元中PC-OxPL水平升高、运动功能障碍和神经元退化均得到改善，同时轻微的神经炎症也趋于正常（文章图5）。
文章图5. PC-OxPL-VecTab®减轻sALS脑脊液诱导的运动功能障碍和运动神经元退化。a. 左图：小鼠硬膜外注射生理盐水或sALS脑脊液后1天，颈椎脊髓的PC-OxPL免疫染色代表性图像。小鼠在sALS脑脊液注射前4周接受了生理盐水或AAV5.2-PC-OxPL-VecTab®的硬膜外注射。右图：在sALS/生理盐水注射后1天以及AAV5.2-PC-OxPL-VecTab®注射后4周，颈椎前角灰质中PC-OxPL免疫染色强度的定量分析。b. 运动缺陷评分和c. 前肢握力的标准化力量：小鼠在硬膜外注射生理盐水或sALS脑脊液后1天的测量结果。小鼠在sALS脑脊液注射前4周接受了生理盐水或AAV5.2-Control的硬膜外注射。d. 上图：小鼠在硬膜外注射生理盐水或sALS脑脊液后1天，颈椎脊髓的ChAT免疫染色代表性图像。下图：在sALS/生理盐水注射后1天以及AAV5.2-PC-OxPL-VecTab®注射后4周，颈椎前角中ChAT+运动神经元数量的定量分析。小鼠在sALS脑脊液注射前4周接受了生理盐水或AAV5.2-PC-OxPL-VecTab®的硬膜外注射。e. PC-OxPL免疫染色强度的定量分析：在硬膜外注射生理盐水或sALS脑脊液后，颈椎前角灰质中的PC-OxPL免疫染色强度。f. 运动缺陷评分和g. 前肢握力的标准化力量：在硬膜外注射生理盐水或sALS脑脊液后，小鼠的测量结果。脑脊液在注射前预先与PC-OxPL-VecTab®或Control-VecTab®孵育。h. 上图：小鼠在硬膜外注射生理盐水或sALS脑脊液后1天，颈椎脊髓的ChAT免疫染色代表性图像。脑脊液在注射前预先与PC-OxPL-VecTab®或Control-VecTab®孵育。下图：在硬膜外注射生理盐水或sALS脑脊液后，颈椎前角中ChAT+运动神经元数量的定量分析。脑脊液在注射前预先与PC-OxPL-VecTab®或Control-VecTab®孵育。
文章图6. 硬膜外给药后迷你猪大脑和脊髓中PC-OxPL-VecTab®的广泛分布。a. 脑脊液流动（箭头）示意图及硬膜外给药后AAV在中枢神经系统不同区域的分布。b. 研究设计及实验分组。c. AAV硬膜外给药后8周，脊髓和大脑皮层中载体DNA水平（基因组拷贝数/微克DNA）。d. AAV硬膜外给药后8周，迷你猪脊髓和大脑皮层中GFP或PC-OxPL-VecTab®转基因mRNA水平（以管家基因Hprt1为参照的倍数变化）。e. 迷你猪脊髓和大脑皮层中载体DNA与mRNA表达的相关性分析。f. 免疫组化检测硬膜外注射AAV-GFP后，迷你猪运动皮层（上）、颈椎脊髓（中）和腰椎脊髓（下）中的GFP蛋白。
四、总结和启示
- 定制化载体构建和AAV包装服务，可携带抗体片段（如scFv、Fab等）或其他治疗基因；
- 多种血清型AAV（包括AAV1–AAV9、AAVrh10等）及新型变体的高质量包装服务；
如需获取更多关于AAV-抗体递送、ALS基因疗法等的最新方案，欢迎联系派真生物，让我们携手加速ALS等神经系统疾病的转化研究与临床应用！
关于派真
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