AAV病毒滴度和纯度检测

AAV病毒滴度检测是评估病毒载体质量和感染能力的重要步骤。以下是几种常见的检测方法：

1.qPCR（定量PCR）

原理：通过荧光标记的特异性引物和探针，对AAV基因组中的特定序列进行定量扩增，从而计算出病毒基因组拷贝数。

优点：灵敏度高、特异性强、适合大批量样本检测。

缺点：不能区分完整和缺失基因组的病毒颗粒。

2.ddPCR（数字PCR）

原理：将样本分成上万个微滴，每个微滴中独立进行PCR反应，通过统计含目标序列的微滴数量来定量。

优点：精确度高，无需标准曲线，适合低拷贝样本检测。

缺点：仪器昂贵，实验时间较长。

3.TCID50

原理：将AAV样品稀释后接种到宿主细胞中，观察细胞病变效应（CPE）或荧光标记蛋白的表达，计算感染性滴度。

优点：直接反映病毒的感染能力。

缺点：耗时长，操作繁琐，依赖细胞系和病毒的感染效率。

4.流式细胞术

原理：AAV感染表达报告基因的细胞后，通过流式细胞仪检测带有荧光的细胞比例。

优点：直观且可定量感染率。

缺点：依赖于报告基因，不能直接用于非标记的AAV载体。

5.透射电镜（TEM）和纳米粒子跟踪分析（NTA）

原理：TEM直接观察病毒颗粒形态，NTA通过测量病毒粒子的散射光或荧光来计数。

优点：能够直观观察病毒颗粒形态，区分空壳和完整颗粒。

缺点：设备昂贵，操作复杂。

 

AAV病毒纯度检测主要用于评估病毒制品中的杂质含量和病毒颗粒的完整性。以下是几种常见的检测方法：

1.SDS-PAGE和银染

原理：通过SDS-PAGE电泳分离AAV衣壳蛋白VP1、VP2和VP3，然后进行染色。

结果：纯度高的AAV样品应呈现三条清晰的蛋白带。

2.Western Blot

原理：使用针对AAV衣壳蛋白的特异性抗体进行免疫检测。

结果：纯度高的AAV样品应仅显示VP蛋白条带，无其他杂蛋白。

3.透射电子显微镜（TEM）

原理：通过负染法或冷冻电镜成像，直接观察病毒颗粒的形态和完整性。

结果：纯净的AAV样品应呈现均一的颗粒结构。

4.qPCR/ddPCR

原理：检测AAV样品中基因组拷贝数（vg），与总蛋白或总颗粒数对比，评估基因组包装比例。

结果：纯度高的AAV应表现出较高的vg/titer比值。

5.ELISA（酶联免疫吸附测定）

原理：使用AAV衣壳蛋白特异性抗体，定量检测总AAV颗粒数。

结果：结合qPCR数据，可以评估空壳比例。

6.离子交换层析和亲和层析

原理：利用AAV颗粒表面的电荷或特异性配体结合，通过层析柱进行纯化和分析。

优点：操作简便，纯度高。

7.超速离心分析（AUC）

原理：通过超速离心分离不同密度的AAV颗粒，计算空壳/实壳比值。

结果：优质的AAV通常具有较高的实壳比例。

AAV病毒滴度和纯度检测方法各有优缺点，实际应用中通常结合多种方法使用，以获得更全面的评估结果。例如，qPCR/ddPCR可用于基因组滴度测定，TEM和SDS-PAGE可用于纯度分析。