在腺相关病毒（AAV）包装过程中，需要特别注意以下事项，以确保实验的成功和病毒的高效生产：
1. 质粒的选择和纯化
质粒纯度：使用高质量的质粒（如 endotoxin-free）是包装成功的关键，因为内毒素可能影响转染效率和细胞活性。
质粒比例：三质粒包装系统（Rep/Cap、腺病毒辅助质粒和目标载体质粒）中，质粒比例需要优化（通常为 1:1:1 或适当调整）。
质粒保存：质粒应避免反复冻融，建议分装保存。
2. 细胞培养
细胞株选择：常用 HEK293T 或 HEK293 细胞，这些细胞对AAV的包装效率高。
细胞状态：细胞密度、活力和健康状况对转染效率有直接影响，细胞状态应达到 80-90% 融合但不过度拥挤。
培养基质量：使用高质量的培养基（如含高水平血清）以维持细胞活性。
3. 转染步骤
转染方法：常用 PEI或脂质体法进行转染。确保转染试剂与 DNA 的比例合适（例如 PEI:DNA = 3:1 或 4:1）。
DNA复合物的形成：混合转染试剂和 DNA 后，需静置10-20分钟，以形成稳定的复合物。
操作无菌：转染过程应在无菌条件下进行，避免污染。
4. 病毒收获
时间点：通常在转染后48-72小时收获病毒颗粒，具体时间根据目的基因表达的情况而定。
细胞与上清液：AAV主要存在于细胞裂解液中，但部分也存在于上清液中。建议同时收集细胞和培养上清液以提高病毒回收效率。
5. 病毒纯化
裂解细胞：常用三冻三融或化学裂解（如 Triton X-100）方法释放病毒颗粒。
沉淀与浓缩：可采用 PEG 沉淀或超速离心浓缩病毒颗粒。
纯化：通过 CsCl 密度梯度离心或 FPLC（如柱层析法）纯化病毒，以去除蛋白质和核酸污染。
质量检测：使用 SDS-PAGE 检测病毒样品纯度，并用 qPCR 或 ELISA 测定病毒滴度。
6. 病毒保存
储存缓冲液：将病毒重悬于合适的缓冲液中以维持活性。
温度控制：病毒可以短期保存在4℃，长期则需储存在-80℃以防失活。
避免冻融：分装病毒，避免反复冻融。
7. 安全性与规范
实验室安全：处理病毒时需佩戴手套和口罩，避免气溶胶污染。
废物处理：含病毒的废液应高压灭菌或用适当消毒剂（如 1% 次氯酸钠）处理。
8. 病毒滴度测定
功能滴度：通过转染敏感细胞株后观察目的基因表达来测定。
物理滴度：采用qPCR、ddPCR 或 ELISA 直接测定病毒基因组或衣壳蛋白量。
9. 常见问题及解决方案
低滴度：可能是转染效率低、质粒质量差或纯化方法不当。优化转染条件和纯化步骤可提高滴度。
污染问题：确保操作无菌，培养基和溶液需预先过滤。
病毒失活：避免冻融，选用适当的缓冲液和储存条件。
关于派真
作为一家专注于AAV 技术十余年，深耕基因治疗领域的CRO&CDMO，派真生物可提供从载体设计、构建到 AAV、慢病毒和 mRNA 服务的一站式解决方案。凭借深厚的技术实力、卓越的运营管理和高标准的服务交付，我们为全球客户提供一站式CMC解决方案，包括从早期概念验证、成药性评估到IIT、IND及BLA的各个阶段。
凭借我们独立知识产权的π-alphaTM 293 细胞AAV高产技术平台，我们能将AAV产量提高多至10倍，每批次产量可达1×10¹⁷vg，以满足多样化的商业化和临床项目需求。此外，我们定制化的mRNA和脂质纳米颗粒（LNP）产品及服务覆盖药物和疫苗开发的各个阶段，从研发到符合GMP的生产，提供端到端的一站式解决方案。
