AAV病毒包装是指将目的基因插入腺相关病毒（AAV）的基因组中，并利用适当的细胞系和辅助质粒系统，包装产生携带该目的基因的重组AAV病毒颗粒。以下是常见的AAV病毒包装步骤：
1. 构建AAV载体
- 目的基因插入AAV载体：将目的基因插入到AAV载体的ITR（Inverted Terminal Repeat）序列之间，通常使用质粒载体进行基因克隆。常用的载体为pAAV系列。
2. 转染包装细胞
- 选择包装细胞系：常用的细胞系是HEK293T细胞，因为它们能高效表达AAV所需的蛋白。
- 辅助质粒：需要两个或三个质粒来进行转染：
- AAV质粒：含有目的基因和ITR序列。
- 包装质粒：提供AAV结构蛋白（如Rep和Cap）。
- 辅助质粒：提供辅助病毒所需的蛋白，如腺病毒的E1、E2、E4和VA基因（常用质粒为pHelper）。
- 通过共转染这些质粒到HEK293T细胞，启动AAV病毒的包装过程。
3. 病毒颗粒收集
- 收集上清液：在转染后48-72小时收集培养基上清液，其中包含AAV病毒颗粒。
- 细胞裂解：如果病毒颗粒主要集中在细胞内，可通过细胞裂解的方法提取AAV病毒颗粒。常用的裂解方法包括冻融循环或超声处理。
4. 纯化AAV病毒
- PEG沉淀：利用聚乙二醇（PEG）沉淀病毒颗粒。
- 密度梯度离心：利用碘克沙醇或氯化铯进行密度梯度离心，分离病毒颗粒。
- 层析纯化：使用离子交换层析或亲和层析等方法进一步纯化AAV颗粒。
5. 病毒滴度测定
- qPCR法：定量PCR可以用于测定病毒基因组的拷贝数。
- ELISA法：利用ELISA可以定量测定AAV衣壳蛋白的含量。
- 荧光标记法：如果目的基因中包含荧光蛋白，可以通过荧光显微镜或流式细胞仪检测转导效率。
6. 病毒储存
- AAV病毒颗粒可以储存在4°C或-80°C下，具体储存条件根据病毒颗粒的纯度和浓度而定，避免反复冻融。
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