慢病毒包装涉及哪些流程？

慢病毒包装通常包括以下几个关键步骤：

1. 质粒设计与构建

质粒设计是慢病毒包装的第一步，通常涉及以下质粒：

• 载体质粒（transfer plasmid）：含有目的基因（如shRNA、sgRNA、蛋白质编码基因）以及用于整合到宿主基因组中的长末端重复序列（LTR）。
• 包装质粒（packaging plasmid）：提供病毒结构蛋白（如Gag、Pol等）的编码信息。
• 包膜质粒（envelope plasmid）：通常使用VSV-G（水疱性口炎病毒糖蛋白）编码质粒，它决定了病毒的宿主范围。

2. 细胞转染

• 选择合适的细胞系（如HEK293T细胞）用于病毒包装。这些细胞易于转染且高效产生病毒颗粒。
• 将载体质粒、包装质粒和包膜质粒共转染到细胞中，通常使用PEI或Lipofectamine等转染试剂。

3. 病毒颗粒收集

• 转染后24-48小时，细胞会开始分泌慢病毒颗粒到培养基中。通常在转染48小时和72小时收集病毒上清液。
• 将收集的上清液通过0.45 μm滤器过滤以去除细胞碎片。

4. 病毒浓缩

• 如果需要高滴度病毒，可以通过超速离心、PEG沉淀或商用的病毒浓缩试剂盒浓缩病毒。
• 浓缩后可以将病毒颗粒重悬于适量缓冲液中。

5. 病毒滴度检测

• 为了确保病毒感染效率，通常会对包装的病毒颗粒进行滴度检测。
• 方法包括：流式细胞术（通过标记GFP或其他报告基因）、荧光定量PCR检测整合到基因组中的病毒基因量，或通过抗生素筛选的克隆形成单位。

6. 病毒保存

• 收集的病毒可以在4°C短期保存，或者在-80°C长期保存。