慢病毒载体递送RNA干扰工具，研究脯氨酸羟化酶结构域酶在调节心肌细胞钙水平中的功能

1. 什么是慢病毒

慢病毒是以HIV-1为基础改造而来的一种病毒载体。在数十年的应用中，慢病毒载体的生物安全性和有效性不断被提升，目前已经成为体内外生物实验中一种功能非常强大的基因递送工具。

在基因递送方面，慢病毒载体拥有诸多独特的优势：稳定持久表达、可感染多种类型细胞、可携带大片段基因、免疫原性比较低等。无论是基础科研还是临床应用，慢病毒载体都具有非常广泛的应用前景。

2. 慢病毒的应用场景

目前慢病毒载体主要应用在以下几个方面：

• 细胞基因治疗（已上市的CAR-T产品有9款采用了慢病毒载体递送CAR基因）
• 基因表达调控（过表达、RNA干扰研究等）
• 基因编辑（CRlSPR/Cas9 gRNA文库筛选、基因敲除、敲入、点突变、基因激活/抑制）
• 稳转细胞株构建
• 活体细胞成像追踪
• 转基因动物

图1 慢病毒载体的主要应用方向

由于高氧消耗，心肌细胞对环境中的氧气极为敏感。脯氨酸羟化酶结构域蛋白2（PHD2）是一种氧气传感器，对细胞缺氧适应性至关重要。近年来的研究发现，PHD抑制剂（PHIs）和针对PHD2的小干扰RNA（PHD2shRNA）可以在不影响细胞能量水平的情况下激活AMPK，将细胞缺氧信号转化为能量代谢信号，使细胞产生能量保护反应，并显著提高细胞对缺氧的抵抗力。研究还发现，信号分子钙（Ca2+）在响应缺氧的AMPK信号通路激活中发挥着重要作用。然而，PHD活性如何增加细胞内Ca2+水平并激活AMPK信号通路的分子机制仍然不清楚。

实验设计和主要研究结果：

1. 确认PHIs 诱导心肌细胞中的钙释放。
2. PHD2 在心肌细胞中激活肌浆网通道辅助蛋白 CaMKⅡ。用shRNA干扰技术敲低心肌细胞中PHD2，Western blot证实了PHD2的沉默。与对照细胞相比，沉默PHD2显著增加了CaMKⅡ的磷酸化。
3. Ca2+ 在心肌细胞中介导 PHI 刺激引起的 AMPK 激活。肌浆网通道抑制剂瑞安诺丁显著降低了PHI处理诱导的与Ca2+相关的荧光强度。慢病毒介导的RyR2特异性shRNA显著降低了RyR2在mRNA水平上的表达。此外， IP3R阻断剂2-APB预处理或慢病毒介导的IP3R特异性shRNA均未显著影响PHI处理诱导的P-AMPK水平。2-APB预处理对PHI诱导的Ca2+荧光也无显著影响。这些结果表明，PHI诱导的钙释放和AMPK激活主要由肌浆网通道而非IP3R通道调节。
4. CaMKⅡ介导PHI诱导的钙释放和AMPK激活。PKA不参与PHI/Ca2+/AMPK信号通路，而CaMKⅡ在PHI/Ca2+/AMPK信号通路中发挥着重要作用。
5. TRPA1介导PHI/Ca2+/AMPK信号通路的激活。TRPA1抑制剂HC030031预处理显著抑制了PHI诱导的P-AMPK和P-CaMKⅡ增加，并显著减少了PHI诱导的Ca2+荧光。PHD2 shRNA组中TRPA1蛋白水平显著高于对照组。这些结果强烈表明TRPA1在PHD诱导的Ca2+释放途径中发挥着至关重要的作用。

图3 慢病毒介导的特异性shRNA对 PHD2、RyR2和IP3R的敲低效果

派真生物有幸为以上研究提供慢病毒。