RNA 激活的 CRISPR/Cas12a 纳米机器及其活细胞成像

2024年8月，环境化学与生态毒理学国家重点实验室彭汉勇课题组在CRISPR基因编辑工具开发方向取得新进展，研究成果以“RNA-activated CRISPR/Cas12a nanorobots operating in living cells ”为题发表在Journal of the American Chemical Society期刊上(Supplementary Cover)。

CRISPR-Cas系统作为一种革命性的基因编辑工具，因其操作简单、编辑精确、效率高等特点，已在分子生物学和基因治疗领域得到了广泛应用。CRISPR基因编辑技术中的Cas蛋白，如Cas12a和Cas13a，能够特异性靶向核酸，并激活反式切割活性，非特异性持续切割单链核酸报告基因。Cas酶的反式切割特性使得检测信号可以被放大，提高了检测的灵敏度，推动了CRISPR技术在超灵敏分析和分子诊断领域的发展。然而，目前这些Cas酶主要用于试管内分析，而在活细胞中的应用受到限制。主要原因为：一、RNA激活的Cas13a会对胞内功能性RNA进行非特异性反式切割，可能对细胞造成伤害，而Cas12a虽然仅反式切割单链DNA，但能否被胞内RNA激活尚未明确；二、活细胞内条件无法达到最佳切割活性，包括Mg²⁺离子、报告基因浓度等，受限于复杂的胞内递送过程。因此，亟需开发新的CRISPR工具，以满足活细胞应用需求。

图1. RNA 激活的 CRISPR/Cas12a 纳米机器及其活细胞成像

环境化学与生态毒理学国家重点实验室彭汉勇团队通过研究Cas12a酶的功能，发现了Cas12a能够被RNA激活，并反式切割DNA报告基因。CRISPR/Cas12a与靶标RNA通过碱基互补配对结合，其反式切割速率随DNA报告基因的延长而增加。这一发现表明Cas12a蛋白是一种独特的“全能型”蛋白酶，能够直接靶向三种类型的核酸，包括RNA、单链DNA、双链DNA，并激活其反式切割活性。该工作还系统评价了CRISPR/Cas12a的RNA/DNA靶向能力及酶切速率，为CRISPR研究提供了定量数据。该发现为CRISPR/Cas结构与功能研究带来了新的视角，将推动病毒检测、疾病诊断、转录组调控、分子成像和基因编辑等领域的CRISPR新技术研发。

图2. RNA 激活的 CRISPR/Cas12a及其反式切割活性评价

为了突破活细胞应用瓶颈，彭汉勇团队基于上述Cas12a新功能，构建了一种高度集成的RNA激活CRISPR/Cas12a纳米机器，用于活细胞中特征miRNA的成像。通过将CRISPR/Cas12a系统及其报告基因组装到纳米金球表面，实现在胞内外CRISPR体系中各组分的化学计量比始终保持不变，不受进胞量的影响。同时，在纳米金表面的有限纳米空间内，Cas12a及其底物报告基因的局部浓度较高，切割速率得到大幅提升。此外，由于Mg²⁺离子与核酸链上磷酸基团的相互作用，使得纳米金表面Mg²⁺离子的局部浓度得到提高，在低Mg²⁺离子浓度下Cas12a仍能保持高切割活性，从而克服了胞内低浓度Mg²⁺离子的限制。将CRISPR/Cas12a纳米机器与细胞进行孵育，在胞内识别特征miRNA后启动，产生持续放大的荧光信号，实现对胞内miRNA的成像。CRISPR/Cas12a纳米机器在活细胞中具有优异的RNA识别能力和胞内成像性能，融合了精准识别、高效运转与自动化操作等特性，同时展现了组件更换的设计灵活性，为开发新的CRISPR工具提供了一种个性化定制平台。

该工作发现RNA可以直接激活CRISPR/Cas12a系统的反式割活性，这一发现打破了之前仅限于DNA激活的认知，并揭示了RNA与DNA激活的Cas12a系统的基因切割性能差异。通过人工合成的CRISPR纳米机器平台，实现CRISPR系统在胞内的高效运转，将在环境病毒监测、细胞毒性机制解析和污染物健康效应研究等方向有着广阔的应用前景。

图3.  CRISPR纳米机器的构建与性能评价

该论文的第一作者为中国科学院生态环境研究中心2021届博士生袁爱姣，通讯作者为彭汉勇研究员。该团队还对核酸纳米机器设计、合成及应用等相关技术进行了系统综述(TrAC-Trend Anal Chem 2023, 158, 116870. TrAC-Trend Anal Chem 2024, 175, 117724.)。该工作得到了国家自然科学基金委面上项目、国家重点研发计划、中国科学院基础与交叉前沿科研先导专项(B类)等项目的支持。

作为一种革命性的基因编辑工具，CRISPR-Cas系统在分子生物学和基因治疗领域有着广泛的应用领域。而RNA能激活Cas12a更是打破仅DNA激活的局限，为CRISPR/Cas结构与功能研究带来全新视角。派真生物CRO & CDMO一站式服务平台，提供从基因合成、载体构建到病毒包装的整体解决方案，产线涵盖AAV、慢病毒包装及mRNA服务，可全面支持您的基因编辑研究。