常见问题

对于科研级质粒，我们会进行如下质量控制（QC）检测项目：

标准检测项目：

• 外观检查（Appearance）：目视观察质粒溶液是否澄清透明，是否存在颗粒或颜色异常。

• A260/280 比值：通过测量在 260 nm（核酸）和 280 nm（蛋白）处的吸光度，评估质粒纯度，理想比值约为 1.8 表示较纯的 DNA。

• 琼脂糖凝胶电泳均一性（Homogeneity by Agarose Gel）：将样品上样至琼脂糖凝胶，检测质粒是否呈现一致的分子量和超螺旋结构比例。

• 酶切分析（Restriction Analysis）：使用特定限制性内切酶切割质粒，通过电泳验证质粒的正确性和完整性。

• LAL 法检测内毒素（Endotoxin by LAL）：使用鲎试剂检测质粒中是否含有细菌内毒素，确保其适用于敏感实验。

可选检测项目（亦适用于临床前质粒 QC）：

• HPLC 法均一性分析（Homogeneity by HPLC）：采用高效液相色谱分析质粒的纯度及超螺旋比例。

• SYBRGold 法检测残留 RNA（Residual RNA）：通过荧光染料 SYBRGold 检测质粒制备中残留的 RNA 含量。

• qPCR 法检测残留大肠杆菌 DNA（Residual E. coli DNA）：使用实时定量 PCR 检测质粒中残留的宿主基因组 DNA。

• 直接接种法微生物限度检测（Bioburden Testing）：将样品直接接种至培养基中，观察是否有微生物生长，评估其无菌水平。

• Sanger 测序（Sequencing by Sanger）：通过 Sanger 法确认质粒插入片段或整个质粒序列的正确性。

• ELISA 法检测宿主残留蛋白（Residual Host Protein）：利用特异性 E. coli 抗体进行 ELISA 检测，识别是否含有残留宿主蛋白。

• qPCR 法支原体检测（Mycoplasma Contamination）：采用高灵敏度 qPCR 检测质粒样品中是否存在支原体污染。

• 电位法 pH 测定（pH by Potentiometry）：测定质粒溶液的 pH 值，确保其在稳定与使用范围内。

• ELISA 法检测残留卡那霉素（Residual Kanamycin）：通过 ELISA 检测质粒制备过程中是否残留卡那霉素抗生素。

• 无菌检测（Sterility）：确认样品中无活菌污染，确保其适用于对无菌要求较高的实验。

• 渗透压检测（Osmolality）：测定质粒溶液的渗透压，确保其适合生物系统使用。

如需我们根据项目需求推荐特定检测组合，也可进一步定制。

我们构建质粒通常采用无缝克隆（Seamless Cloning）技术。

无缝克隆是一种能够在不引入额外核苷酸的情况下，将目标 DNA 片段精确插入质粒载体的方法，避免了传统限制性内切酶法常见的连接位点残留问题。这对于蛋白表达尤为关键，因为哪怕是多出几个氨基酸，也可能影响蛋白功能。目前常用的方法包括重叠延伸 PCR、Gibson 组装及商业化无缝克隆试剂盒等。

✅ 无缝克隆的关键步骤：

1. 构建带有重叠序列的片段：
通过 PCR 扩增目标片段，设计引物时在 5' 端加入与质粒或其它片段互补的重叠区（一般为 15–25 个碱基）。

2. 重叠区退火：
将含互补重叠区的 DNA 片段混合，重叠区域在体外条件下自然配对形成稳定结构。

3. 延伸与连接：

• DNA 聚合酶延伸退火后的 3' 缺口；

• DNA 连接酶封闭磷酸二酯键（或使用集成体系一次完成所有步骤）。

🧬 反应体系要求：

⚖️ 优缺点对比：

优点：

• 精确插入目标片段，无多余碱基；

• 无需限制酶位点，设计更灵活；

• 引物设计相对简化。

缺点：

• 引物设计需确保正确重叠方向和长度；

• 克隆效率受片段大小、结构复杂度等因素影响；

• 某些商业试剂盒成本较高。

🔍 实用技巧：

• 重叠长度建议：15–25 个碱基能保证大多数小片段高效退火，较大片段可适当延长。

• DNA纯度：PCR 后建议进行凝胶纯化，确保片段无杂质，提高拼接效率。

• 设阴性对照：建议设置无插入片段的阴性对照，排查背景噪音或非特异性连接。

我们根据不同的应用需求，使用以下几种大肠杆菌菌株进行克隆与质粒制备：

1. DH5α

基因型：F⁻, φ80dlacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, recA1, endA1, hsdR17(rK⁻, mK⁺), phoA, supE44, λ⁻, thi-1, gyrA96, relA1
应用场景：常用于常规克隆和蓝白斑筛选。recA 和 endA 突变可提高质粒稳定性和转化效率，是通用克隆中最常用的菌株之一。

2. Top102. top10

基因型：F⁻, mcrA, Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), φ80lacZΔM15, ΔlacX74, recA1, araD139, Δ(ara-leu)7697, galU, galK, λ⁻, rpsL(StrR), endA1, nupG
应用场景：适用于高效克隆和蓝白斑筛选，转化效率高，常用于需要获得大量转化子的实验中。

3. Stbl3

基因型：F⁻, mcrB, mrr, hsdS20(rB⁻, mB⁻), recA13, supE44, ara-14, galK2, lacY1, proA2, rpsL20(StrR), xyl-5, λ⁻, leu, mtl-1
应用场景：适合克隆含重复序列的质粒（如慢病毒质粒中的 LTR 结构）。recA 突变可降低重组风险，提升复杂构建体的稳定性。

4. XL-10

基因型：TetR Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac Hte [F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (TetR) Amy CamR]
应用场景：优化用于高效转化，特别适合大分子或甲基化 DNA 的克隆。由于 recA 突变，也适用于不稳定或有毒序列的克隆，并支持蓝白斑筛选。

5. NEB Stable

基因型：F′ proA⁺B⁺ lacIq Δ(lacZ)M15 Tn10 (TetR) endA1 recA1 hsdR17(rK⁻ mK⁺) glnV44 λ⁻ thi-1 gyrA96 relA1 spoT1
应用场景：适合维护在其他菌株中容易发生重组或降解的不稳定质粒，适用于大质粒或易重组构建体的克隆，具备较好的产量和长期稳定性。

质粒中的抗生素抗性基因可赋予宿主细胞在特定抗生素存在的环境下存活的能力，常作为筛选标记使用。通过在培养基中加入相应抗生素，仅允许成功转入质粒的细胞（即转化细胞）生长，从而实现有效筛选。常见的抗性基因包括 AmpR（对氨苄青霉素具有抗性）和 KanR（对卡那霉素具有抗性）。研究人员利用抗生素筛选手段来筛选并维持含有目标质粒的细胞群体。

在质粒中引入 poly(A) 信号，可以确保目标基因转录产生的 mRNA 能被正确加工，生成更稳定且更易于翻译的转录产物。

调控元件是指质粒中用于调节目标基因表达的序列。常见的一种调控元件是 WPRE，它能够增强 mRNA 的稳定性和翻译效率，因此常被引入病毒载体或质粒中，以提高基因表达水平，从而在宿主细胞中产生更高水平的蛋白质。

除此之外，其他调控元件还可能参与调控转录速率、RNA 剪接或 mRNA 的转运等过程。

开放阅读框（ORF）是指 DNA 中一段由密码子组成的连续序列，以起始密码子（通常为 AUG）开始，以终止密码子（如 UAA、UAG 或 UGA）结束。ORF 是基因中可被翻译成蛋白质的部分。在质粒设计中，ORF 通常包含研究人员希望在宿主细胞中表达的目标基因。ORF 的正确表达对于成功获得所编码的蛋白质至关重要。

多克隆位点（MCS），也称为多连接酶位点（polylinker），是一段较短的 DNA 序列，包含多个独特的限制性内切酶识别位点。通过这些位点，研究人员可以将目标基因精确地插入至质粒的特定位置。MCS 提供了在限制酶选择上的灵活性，从而简化了克隆操作，使外源 DNA 片段更容易整合进质粒而不干扰其他关键元件。

如今，在基因插入操作中，研究人员更倾向于采用无缝克隆方法而非传统的限制酶切位点插入方式。但 MCS 中的限制酶位点依然在无缝克隆中作为质粒线性化的便捷位点，具有实用价值。