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帕金森病研究新突破：Parkin基因缺失猴模型揭示帕金森病发病新机制和治疗靶点

11 月 18 , 2024
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帕金森病（PD）是全球第二大神经退行性疾病，65岁以上人群中患病率约2%，其特征为中脑黑质脑区多巴胺神经细胞退变和病理性α-synuclein蛋白聚集。约10%的PD由基因突变引起，尤其是PINK1和Parkin基因。大量的体外研究表明PINK1激活Parkin，共同促进受损线粒体清除，保护神经细胞。然而，目前缺乏生理状态下PINK1激活Parkin的体内证据，且现有动物模型无法模拟PD的神经退变特征，这限制了对PINK1和Parkin功能的研究。

2024年10月15日，暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院的杨伟莉、李世华及李晓江团队在国际医学研究领域权威期刊Journal of Clinical Investigation(IF=13.3)在线发表题为“Deficiency of Parkin causes neurodegeneration and accumulation of pathological α-synuclein in monkey models”的研究论文。研究团队通过基因编辑技术构建了Parkin基因缺失猴模型，确定了Parkin磷酸化是帕金森病发病的关键因素，为帕金森病的发病机制和潜在治疗方案提供了新视角。

研究亮点

首次构建灵长类Parkin基因敲除模型：首次在灵长类（猴子）中构建Parkin基因缺失模型，并观察到与人类帕金森病类似的黑质神经元退行性变和pS129-α-突触核蛋白积累，而以往的小鼠和猪模型中Parkin缺失并未导致显著的神经退行性病变，这一发现强调了灵长类模型在帕金森病研究中的独特性和必要性。

首次在体内证实Parkin磷酸化的关键作用：研究发现，在灵长类动物中，PINK1激活Parkin的S65磷酸化对神经保护至关重要，能减少有毒α-突触核蛋白积累。这项研究首次在体内证实了PINK1与Parkin磷酸化的关系，强调了Parkin磷酸化在神经元存活和帕金森病发病中的重要作用。

治疗潜力的验证：该研究通过用AAV过表达野生型Parkin，验证了Parkin磷酸化可以有效减少毒性pS129-α-突触核蛋白的积累，指出增强Parkin活性作为帕金森病潜在治疗方案的可行性。

主要研究结果

1、猴PARK2基因缺失导致年龄依赖性神经退行性变化

利用CRISPR/Cas9技术构建不同年龄的Parkin基因缺失猴模型,发现Parkin缺失对猴大脑早期发育中的神经细胞存活无明显影响，但随年龄增长，猴中脑黑质多巴胺神经细胞出现明显变性及死亡，纹状体部位多巴胺合成减少（图1），病理性pS129-α-syn聚集，成功模拟了PD病人脑中的重要病理特征，这与Parkin敲除的小鼠模型及猪模型无法模拟PD病人脑中神经细胞退变死亡的重要病理形成鲜明对比。

图1敲除Parkin导致成年猴中脑黑质多巴胺神经细胞的退变死亡。(A) 通过立体定位注射AAV9-parkin gRNA-RFP/Cas9到猴脑区域，敲除猴Parkin基因（PARK2）。(B) 低倍显微镜照片，通过RFP反映的病毒在注射猴黑质区的感染情况。(C) 双重免疫荧光染色显示，AAV9-parkin gRNA-RFP/Cas9感染的黑质神经元（箭头所示）Parkin表达减少。(D和E) 免疫荧光染色显示，Parkin敲除导致猴子黑质中的TH阳性神经元数量减少，且在年老（25岁）猴中的神经元减少更为严重。（E）。(F) 注射AAV-Cas9/对照gRNA和AAV-Cas9/parkin-gRNA的猴子黑质中TH阳性神经元数量统计。

2.PINK1与Parkin磷酸化的关系

已有的体外研究发现PINK1可在Ser65位点磷酸化激活Parkin，但由于PINK1蛋白在生理状态下的小动物脑内及常见细胞系中表达较低，检测不到，因此尚无生理状态下的体内证据证明PINK1介导Parkin的磷酸化。本研究发现敲除PINK1基因可明显减少磷酸化Parkin(pS65-Parkin)表达，并伴随出现由pS129-α-syn蛋白聚集而成的路易氏小体（图2）。

图2. PINK1缺失可导致猴中脑黑质中的Parkin磷酸化水平显著下调，病理性S129-α-synuclein蛋白表达明显增加。猴脑区注射AAV病毒载体表达CRISPR/Cas9敲除PINK1基因后，Western blot结果（A）和免疫组化染色（B-C）显示，磷酸化Parkin（pS65-Parkin）明显减少，而毒性的α-synuclein蛋白显著增加。（D）高倍镜下有毒性α-synuclein蛋白形成路易小体。

3.Parkin磷酸化的作用（图3）

研究发现，随着年龄增长，Parkin磷酸化水平显著降低，导致pS129-α-syn的积累。在正常衰老猴脑的黑质区域中，Parkin蛋白的不溶性增加，伴随更高水平的氧化应激产物（如yH2AX和8-OhdG）积累，这进一步加速了pS129-α-syn的堆积，提示衰老可能是引发磷酸化Parkin功能下调从而介导脑功能异常的一个重要因素。

进一步研究结果显示Parkin蛋白的S65磷酸化在PINK1依赖的神经保护中起重要作用。过表达野生型PINK1和Parkin均可通过增加Parkin磷酸化水平而减少老年猴脑中病理性α-synuclein蛋白的聚集，而无法被PINK1磷酸化激活的Parkin突变体(S65A)则无此效果。

图3磷酸化Parkin在PD病理中的重要机制模型。在正常的灵长类动物大脑中，PINK1蛋白发挥激酶功能磷酸化激活Parkin，磷酸化形式的S65-Parkin通过清除pS129-α-syn等毒性蛋白使黑质神经元维持健康状态。然而，PD病人脑内，当发生Parkin或PINK1突变以及衰老造成的氧化应激时Parkin磷酸化水平降低，进而导致pS129-α-syn 等毒性蛋白积累，并最终导致患者脑内发生年龄依赖性的神经退变。

结论

本研究首次揭示了在生理状态下的动物体内PINK1激酶可磷酸化Parkin的证据，且Parkin 磷酸化的减少与pS129-α-syn蛋白的聚集相关，而通过提高Parkin蛋白磷酸化水平可显著减少pS129-α-syn蛋白的聚集毒性，从而对神经细胞起到有效的保护作用。这为携带PINK1及Parkin突变的PD患者在临床上具有相似的表型提供了新的分子机制，同时也表明增强Parkin活性可能成为帕金森病治疗的潜在策略。

派真生物有幸为本研究提供了基因编辑和基因过表达AAV病毒包装服务，助力帕金森病研究。同时派真CRO &CTDMO 一站式服务平台，可提供从基因合成、载体构建，到病毒包装的整体解决方案，更有专为猴子等大动物实验专门研发的NHP级别AAV, 产量和安全性更高，全面支持您的基因治疗研究。

本篇文章AAV的导入方式：

实验动物 猕猴
血清型 AAV9
启动子 CMV, U6
注射方式 脑立体定位注射至前额皮质、纹状体或黑质
注射剂量 病毒滴度1 x 10^13 vg/mL，注射体积5~10 μL
检测时间 感染后2-3个月

关于派真

作为一家专注于AAV 技术十余年，深耕基因治疗领域的CRO&CDMO，派真生物可提供从载体设计、构建到 AAV、慢病毒和 mRNA 服务的一站式解决方案。凭借深厚的技术实力、卓越的运营管理和高标准的服务交付，我们为全球客户提供一站式CMC解决方案，包括从早期概念验证、成药性评估到IIT、IND及BLA的各个阶段。

 

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