基因治疗载体——慢病毒包装步骤

慢病毒包装一般涉及以下步骤：

1. 准备质粒

通常慢病毒系统需要三种质粒：

• 转移质粒（Transfer plasmid）：携带目标基因以及相关的启动子和报告基因（如GFP或mCherry）。
• 包装质粒（Packaging plasmid）：提供病毒的结构蛋白和酶（如Gag、Pol）。
• 包膜质粒（Envelope plasmid）：提供包膜蛋白（通常是VSV-G）。

2. 细胞转染

1. 使用HEK293T或HEK293FT等细胞系，培养至合适的细胞密度（通常为70-80%）。
2. 将质粒与转染试剂混合，按照一定比例共转染到细胞中。

   • 一般推荐使用CaCl₂法或脂质体转染（如Lipofectamine 2000或PEI）。

3. 培养细胞并收集病毒上清

1. 转染后24小时更换培养基以减少细胞死亡。
2. 48小时和72小时分别收集细胞上清，离心去除细胞碎片。
3. 如果需要更高的病毒滴度，可以浓缩病毒，如超速离心或PEG沉淀。

4. 病毒滴度检测（可选）

1. 使用荧光显微镜检测报告基因（如GFP）的表达，或者用QPCR或ELISA检测病毒载量。
2. 滴度计算有助于确定病毒的感染效率。

5. 保存和使用病毒

1. 收集的病毒可以在4℃短期保存，或-80℃长期保存。
2. 使用前可以进行稀释，并直接用于靶细胞感染。

在实际操作中，严格的无菌操作和生物安全规范是至关重要的，因为慢病毒具有感染多种细胞的潜在风险。