腺相关病毒（AAV）三质粒包装系统是一种常用的基因转移工具，主要用于在细胞和动物模型中转入基因，研究基因功能或开发基因治疗方案。以下是AAV三质粒包装系统的组成和包装步骤：
三质粒包装系统组成：
- 转移质粒（rAAV质粒）：包含要传递的目标基因序列，通常位于两个AAV反向末端重复(ITRs)序列之间。ITRs是唯一从野生型AAV中借用的序列，对于rAAV包装和整合至宿主细胞的基因组至关重要。
- 辅助质粒（Rep-Cap质粒）：携带必需的rep和cap基因，这些基因编码AAV的复制(Rep)和衣壳(Cap)蛋白。Rep蛋白负责复制rAAV质粒，而Cap蛋白负责形成能够包裹rAAV质粒DNA的病毒盖壳。
- 助病毒质粒（Ad Helper质粒）：提供额外的Adenovirus蛋白，这些蛋白在包装过程中是必需的但不会被包含在最终的rAAV颗粒中。这些蛋白的功能包括增强病毒的复制、组装和细胞释放过程。
包装步骤：
- 细胞培养：在适宜的细胞系（如HEK293）中培养细胞，通常经过调优以最大化产量。
- 共转染：将上述三种质粒共同转染入HEK293细胞中。三种质粒的比例和效率至关重要，一般根据实验的需求调整。
- 病毒收集：经过约48-72小时的生产时间，收集包含rAAV的细胞和培养上清。
- 纯化：通过一系列纯化步骤，如离心和选择性过滤或色谱，从细胞混合物中提取rAAV颗粒。
- 滴度测定：通过qPCR等方法量化rAAV颗粒的数量，确保递送的基因剂量精确可控。
- 质量控制：包括测试rAAV的纯度、潜在的污染物，如宿主细胞DNA，以及病毒颗粒的生物活性等。
三质粒包装系统是rAAV生产中的一个标准技术，因为它提供了一个简化和模块化的方法来生产不同血清型和遗传构造的rAAV颗粒。这个系统以其高产率、较低的病原性和可调整性，成为在临床前研究和治疗性应用中普遍采用的一种包装平台
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