AAV（腺相关病毒）虽因安全性高、感染高效特异、基因组整合率低等优点，成为了基因治疗的“黄金载体”。然而，不同的AAV血清型在不同物种、甚至不同小鼠品系中的表现却存在大幅差异。比如，部分在 C57BL/6 小鼠中“表现优异”的血清型，在 BALB/c 小鼠或食蟹猴体内的转导效率会截然不同。不同血清型在动物模型与人体间的转导效率差异也一直是AAV基因疗法临床前评估的难点。
一、研究思路：条形码文库 + 多器官检测
1、条形码文库的构建：21 种 AAV 血清型，包括AAV1-AAV9（为了增加AAV6血清型的产量，用AAV6.2FF代替AAV6）、rh10、rh74、DJ、ie、LK03、B1、HSC15、PHP.B、PHP.eB、PHP.S、CAP-B10和 MyoAAV-2A，各自携带不同的 7-nt 条形码，混合形成AAV文库。
2、多宿主平行测试：分别给C57BL/6 与 BALB/c 小鼠（n=3）以及食蟹猴（n=3）静脉注射混合的 AAV 文库。
3、多组织/多水平检测：感染后三周，采集肝、脑、心肌、骨骼肌、肺、胰腺、肾脏等组织，用 qPCR、条形码测序、免疫组化和荧光蛋白检测等方法在DNA、RNA和蛋白质水平检测各血清型的丰度。
二、主要研究结果
1. 不同小鼠品系间的显著差异
- 与 C57BL/6 相比，BALB/c 小鼠普遍出现更低的AAV RNA 表达，尤其是在脑、脊髓、肺及骨髓等组织（文章图1D）。
- AAV9、PHP.B、PHP.eB和CAP-B10在C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠之间表现出较大的转导模式差异（文章图1I），AAV9、PHP.B在 BALB/c 中的转导效率明显降低，其中AAV-PHP.B 在中枢神经系统及其他组织均呈大幅下降（文章图1J-K）。
- 启示：同为小鼠，品系差异就足以颠覆某些 AAV 的“神操作”。在做小鼠实验时，需谨慎选用品系并关注预期转导效率差别。
文章图1 C57BL/6与BALB/c小鼠之间的AAV转导差异。（A）含有两组7-核苷酸条形码的AAV构建示意图。（B）C57BL/6和BALB/c小鼠中AAV嗜性分析流程示意图。将5E+12 vg/kg的AAV文库通过静脉注射到小鼠体内（n=3）。在DNA、RNA和蛋白水平评估AAV文库的感染和转导效率。（C）利用qPCR对C57BL/6和BALB/c小鼠中AAV的DNA丰度进行定量分析。以小鼠Gapdh基因作为内参，将载体拷贝数标准化至每个二倍体基因组。（D）对C57BL/6和BALB/c小鼠中AAV的RNA丰度进行定量分析。（E-H）脑（E）、脊髓（F）、肺（G）和骨髓（H）组织中tdTomato表达的代表性图像。右侧图表显示tdTomato阳性细胞在全部细胞中的比例。（I）通过皮尔逊相关性分析揭示C57BL/6和BALB/c小鼠中各AAV血清型转导模式的差异。（J-K）对C57BL/c和BALB/c小鼠中AAV-PHP.B（J）或AAV9（K）的AAV RNA丰度进行定量分析。
2. 食蟹猴与小鼠间的跨物种差异
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食蟹猴大部分器官的 AAV RNA 表达普遍低于 C57BL/6 小鼠，或与灵长类更复杂的免疫及受体表达差异相关。 -
AAV4、AAV5、PHP.B、PHP.eB、CAP-B10和MyoAAV-2A在小鼠与食蟹猴中表现“判若两人”，小鼠中高效，猴体内却明显乏力（文章图3）。
文章图3 C57BL/6小鼠与食蟹猴各AAV血清型的转导差异。(A) 每种血清型在食蟹猴（n=3）中的AAV DNA丰度热图。每种衣壳的DNA丰度根据AAV文库的总DNA丰度及其比例计算得出的。热图中的每三个单元格分别代表三只独立食蟹猴的数据，以展示个体间的差异。(B) 每种血清型在食蟹猴（n=3）中的AAV RNA丰度热图。(C) 通过皮尔逊相关性分析揭示各AAV衣壳在C57BL/6小鼠和食蟹猴之间转导模式的差异。(D-E) 对C57BL/6小鼠和食蟹猴中AAV4（D）或AAV.CAP-B10（E）的AAV RNA丰度进行定量分析。
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启示：基于小鼠筛选的最优血清型并不一定适用于灵长类，需提前考虑预存抗体及免疫适配方案。
- AAV4在 C57BL/6、BALB/c 小鼠及食蟹猴中均表现出对肝脏的低转导，但在肺组织、胰岛及肾小球中的转导效率却更高(文章图5)；
- 机制或与其受体差异相关：AAV4 和其他血清型在衣壳结构和 O-型糖基受体结合方面的差异，或为其独特“分布”提供了基础；
- 潜在应用：有望为相关呼吸系统、内分泌/糖尿病研究带来新思路。
文章图5 AAV4在C57BL/6小鼠中表现出与AAV9不同的转导模式。(A) AAV4和AAV9在C57BL/6小鼠中的嗜性分析流程示意图。将3×10¹² vg/kg的AAV4或AAV9通过静脉注射到小鼠体内（n=3）。在DNA、RNA和蛋白质水平上评估AAV文库的感染和转导效率。(B) AAV4和AAV9 的DNA丰度定量分析。(C) AAV4和AAV9的RNA丰度定量分析。(D-I) AAV4或AAV9在组织中递送的tdTomato表达的代表性图像，包括肝脏（D）、棕色脂肪（E）、睾丸（F）、肺（G）、胰腺（H）和肾脏（I）。右侧图表显示了tdTomato阳性细胞的比例。白色虚线圆圈分别标记了肾脏中的肾小球和胰腺中的胰岛。(J) 食蟹猴中AAV4 的DNA丰度定量分析。(K) 食蟹猴中每种AAV的DNA丰度热图。每种衣壳的DNA丰度根据AAV文库的总DNA丰度及其比例计算得出。
4. 不同物种中的AAV实验，如何“按需选型”？
（4）肺、胰腺和肾：AAV4 反而在这些“冷门”器官中异军突起，值得深入挖掘。
4、在食蟹猴中，作者观察到AAV2、4、5、DJ和MyoAAV-2A等衣壳变体的载体DNA进入量减少了50%，这表明所用的食蟹猴中存在预存的AAV NAb（文章图S6A）。由于在食蟹猴中几乎不可能找到对所有AAV衣壳变体都没有预存抗体的个体，而预存的NAb可能会影响AAV的转导，因此本研究呈现的结果有可能受到了食蟹猴体内不同血清型特异性的中和抗体的影响。
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